在对6例伴发限局性Castleman病的副肿瘤性天疱疮患者(paraneoplastic pemphigus, PNP)的诊疗过程中，我们发现患者皮肤黏膜损害对大剂量皮质类固醇及多种免疫抑制剂治疗均不敏感，但肿瘤切除以后再辅以皮质类固醇治疗，皮损可在6-9周内恢复;血清抗体滴度在5-9周内转阴性，不仅与皮损的恢复速度基本一致，而且与体内抗体的正常生理代谢速度基本吻合。这些资料提示可能是肿瘤直接产生了致病性抗体而引发PNP的皮肤黏膜免疫损伤。Castleman病又称巨大淋巴结增生，是一种界于良、恶性之间的不典型淋巴结增生症，在临床上分为限局型和多中心型，组织学上分为透明血管型、浆细胞型及界于两者间的混合型。Castleman病可以独立存在，也可以伴发高球蛋白血症、POEMS综合征等其他疾病。近年来发现，他是PNP患者较为常见的肿瘤之一。为深入探讨Castleman病在PNP发病过程中的作用，我们对6例PNP患者所伴发Castleman病的组织学和免疫遗传学特点进行研究，并与3例淋巴结反应性增生和6例无皮肤黏膜损害的Castleman病进行了比较。
资料和方法
一、组织病理标本
6例伴限局性Castleman病的PNP患者液氮冻存肿瘤组织用于RNA提取，将其中5例PNP患者的石蜡包埋肿瘤组织块(例1的石蜡包埋肿瘤组织块未获得),6例无皮肤黏膜损害的Castleman病患者的肿瘤组织、3例反应性淋巴结增生患者的淋巴结进行常规病理切片并烘干固定，分别用于免疫组化和原位杂交(全部标本均由我院病理科提供)。
二、免疫组化
取6例PNP患者的石蜡包埋肿瘤组织块做常规免疫组化染色(SABC法)，分别以抗T,B淋巴细胞表面标志性抗原(CD45Ro及CD20)的抗体为一抗。阳性信号为棕黄色颗粒，细胞膜着色。
三、RT-PCR及克隆测序
Trizol试剂一步法从冰冻肿瘤组织中提取总RNA，逆转录得到cDNA;各取相应上、下游引物按文献所列条件进行常规PCR扩增，得到免疫球蛋白重链可变区基因的第三互补决定区(CDR3)。PCR产物经8%聚丙烯凝胶电泳，硝酸银染显色鉴定:若只出现1条锐利条带，则为单克隆;若相应条带多于2条则为寡克隆;如果泳道中多数条带不在目的片段长度范围之内、出现边界不清弥漫条带或无任何条带，则为多克隆。将6例患者PCR扩增产物和pBluescipt SK(+)质粒分别进行Sal I ,Pst I双酶切，构建测序质粒，转化感受态DH5a大肠杆菌。每一患者皆挑取10个克隆进行测序。阳性对照分别来自B系肿瘤细胞Namalwa细胞(我院血液科惠赠)，空白对照为三蒸水。
四、探针标记
以例1为模板，采用体外转录法标记RNA探针。质粒经Sal I和BamH I分别酶切、酚/氯仿抽提得到2种无RNase的5'端突出纯化线性质粒。以上述线性质粒为模板，加入[a-32p]UTP(北京亚辉公司)，分别以T3或T3RNA聚合酶体外转录得到放射性标记的反义链和正义链探针。原位杂交探针制备方法基本同上，以DIG-UTP为标记碱基，探针合成皆按标记试剂盒(美国Promega公司)操作说明书进行。
五、RNA印迹
提取6例患者肿瘤组织mRNA和1例行门诊扁桃体切除术患者的扁桃体组织mRNA，常规方法进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳及转膜。应用ExpressHyb杂交液(美国Clontech公司)按照操作说明书进行杂交、洗膜、曝光。
六、原位杂交(ISH )
用二甲苯将切片脱蜡，梯度乙醇水化，滴加蛋白酶K于37C孵育20min，加入地高辛标记的变性RNA探针和杂交液，常规方法进行杂交、洗片，碱性磷酸酶显色。胞浆中出现暗紫色颗粒为阳性，无染色为阴性。
结果
一、免疫组化结果
所有患者淋巴滤泡中的大多数细胞胞膜CD20染色阳性，滤泡间隙CD45Ro阳性细胞散在分布。
二、RT-PCR结果
RT-PCR扩增6例RNP患者的cDNA皆获得1条稍>124 bp的锐利条带，和阳性对照Namalwa细胞系一样呈单克隆表现。
三、RT-PCR产物克隆测序结果
将扩增产物克隆测序得到128bp,122bp两种序列，且同一长度的序列间具有高度的一致性。长度为128bp的序列见于所有患者，克隆间仅存在12个碱基差异，以42位碱基G-C的出现频率最高。长度为122bp的序列见于4例患者，除例4的1个克隆与其他克隆有6个碱基差异外，其他均仅有1个碱基差异，克隆间存在更高程度的一致性。
四、原位杂交
以反义链探针进行杂交，5例PNP患者肿瘤淋巴滤泡中大部分细胞胞浆呈暗紫色，证明标本中确有与探针互补的目的片段mRNA存在;而6例无皮肤黏膜表现的Castleman病患者肿瘤组织的淋巴滤泡和3例淋巴结反应性增生患者的淋巴组织细胞中均未见染色。以标记正义链为探针与5例PNP患者肿瘤切片进行杂交则未见肿瘤细胞胞浆着色。
五、RNA印迹
以a-32P标记的RNA探针与6例PNP患者的肿瘤mRNA杂交，将洗脱条件控制在较高的条件下，皆有较强的杂交信号出现，说明这一段序列在肿瘤组织中有丰富表达;而相同条件下扁桃体电泳道中则无相应的杂交信号，充分说明该探针具有很高的特异性。
讨论
PNP的特点之一就是伴发良、恶性肿瘤，且多以淋巴系统肿瘤为主。许多研究者认为是肿瘤的存在引起皮肤黏膜的损伤。肿瘤引起皮肤自身免疫损伤的原因还不清楚。免疫组化法分析Castleman病肿瘤组织中主要以B细胞为主，而且分布与正常淋巴滤泡相似。进一步分析肿瘤B细胞的克隆构成发现，6例患者肿瘤B细胞免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因重排的方式是相同的。我们认为这种相同不是一种偶然现象。首先，IgVH基因定位于14q32.3，约包含60-200个互不相同的VH基因片段，30个DH基因片段和6个JH基因片段。这些大小不等的基因片段在B细胞分化成熟过程中以VH-DH-JH顺序随机排列组合，在VH-DH和DH-JH连接区又可随机插入和删除5-20个碱基，理论上可得到多种不同的重排方式。在如此庞大的背景下，6例患者所得序列基本一致是疾病的必然结果，而不是巧合。其次，在RT-PCR操作中采取措施避免污染因素。每一标本至少进行3次PCR，每1次都设有阳性对照、空白对照及阴性对照。
原位杂交结果证明，6例PNP患者肿瘤B细胞免疫球蛋白重链基因重排方式具有特异性，也就是说6例PNP患者肿瘤中的主要B细胞克隆是相同的，而这一克隆在无皮肤黏膜表现的Castleman病患者肿瘤组织和淋巴结反应性增生患者中不存在或至少不是主要克隆。应用较为敏感的PCR检测法证明，只有6例PNP患者的肿瘤组织存在单克隆或寡克隆B细胞，其他患者肿瘤组织为多克隆B细胞。这一结果是肿瘤组织B细胞组成的真实体现，而不是模板质量问题引起的假阴性结果，因为所有标本模板DNA都能经B肌动蛋白引物进行有效扩增。原位杂交结果证明6例PNP患者肿瘤组织的淋巴滤泡样结构中存在相同的特异B细胞克隆，而这一克隆B细胞不存在或不是6例皮肤黏膜未累及的Castleman病患者和3例淋巴结反应性增生患者的主要B细胞克隆。6例PNP患者Castleman病肿瘤组织结构与正常淋巴结相似，肿瘤中存在大量B细胞，这些B细胞具有相同或极为相近的IgVH基因重排方式，并且在肿瘤组织中有丰富表达，可产生相同特异性和一定亲和力的抗体。结合临床资料，我们认为伴发Castleman病的PNP患者发病机制是肿瘤直接分泌抗体引起皮肤黏膜的免疫损伤。
